CHO细胞培养常见问题及解析

2016-05-10
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CHO细胞培养常见问题及解析

1、问:文献报道说用DMEM培养基来养CHO细胞,是高糖还是低糖?

参考见解:CHO细胞用高糖DMEM养就可以了,比较好养,10%胎牛血清,大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养,如果在玻璃板上养而且不包被的话,细胞不易伸展开来。

2、问:要转染钾通道pcDNA3.1入细胞,是选CHO细胞呢还是hek293细胞?CHO细胞转染效率高吗?

参考见解:表达一个蛋白的时候,首先要确认你的蛋白确实表达了,因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题(质粒序列有错误,质粒纯度低,表达的蛋白不稳定,转染效率太低等)。所以在做任何功能性实验之前,必须要先确认蛋白的表达,通常的实验有:

(1)采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗,比较贵。但直观,可以确定转染效率,采用好的显微镜时,可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。

(2)WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量,以及表达的量。但不直观。

(3)构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间,同时携带的荧光蛋(通常使用GFP)有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率,蛋白在细胞中的位置等。

当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变,所以如果你的蛋白有表达但没有功能,首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。

3、问:由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体,用什么培养基能够很好的使之良好的生长?

参考见解:

无血清培养CHO细胞可以直接向伟通生物购买。细胞的无血清驯化过程是,CHO细胞先在含10%血清的常规培养基里培养,再到含5%血清的培养基里培养,再到含2.5%血清的培养基里培养,依此类推,培养基里的血清不断下降,直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤,直接由起点的血清浓度到终点浓度。

4、问:我要做稳定转染,表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1,没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问:

有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种?野生型CHO细胞又是指的哪种?这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达,比野生型CHO在转染中更起作用?

如果就我的实验要求,CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合,那么转染CHO-K1是不是可以直接转染?而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染?

参考见解:做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的,这个载体同时可以过表达一个抗性基因,如果载体整和到基因组上,这个抗性已经能够克服筛选压力,而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。

(1)野生型CHO就是CHO-K1

(2)CHO-DHFR-是指DHFR缺陷型细胞,DHFR作为筛选标记.

(3)你用pcDNA3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可.

5、问:最近作试验需要用到CHO细胞,老师从广西带回两瓶,本来用的是DMEM培养液,由于我没有接触过细胞这方面的知识,上网查了下培养液,说1640就可以,就仓促用了1640,两天过去了贴壁很不好,估计是要完了,求救。

参考见解1:

(1)带回来的细胞瓶汇合度大概多少?一般送人的细胞汇合度大概80-90%,且瓶里加满培养液,再包装。细胞生长旺盛,便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置,细胞接触不到培养液而死亡或活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧,我们一般1:3分瓶。不分瓶培养可想而知了。

(2)如果上述没错的话,准备好正确的完全培养液,将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集,合并一下,铺底大概30%。正常培养。

(3)关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。除非你的老师带回来的细胞存在问题。

参考见解2:37度预热胰酶,吸除培养瓶中的培养液,PBS(无钙镁)洗涤细胞1次后,加入少量胰酶,覆盖细胞即可。轻轻摇动(前后左右)。镜下观察细胞状态,一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化(防止过渡消化)。加入完全培养液(必须含胎牛血清)终止消化反应。湾头吸管顺序吹打细胞,小心避免产生气泡(对细胞有害)。镜下观察细胞,细胞分散即可后续操作。如果是新手,保留上清以防不测,别倒掉。

6、问:最近要在无血清条件下养CHO细胞,要作些准备?但不知道其培养也是什么?

培养基方案可以在伟通生物的cho细胞无血清培养基说明书中找到。

7、问:这两个月,CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去,同期转瓶生长正常,基本排除细胞及培养基的问题,换罐做也出现同种现象,可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比,只是接入培养液体积由1.5升该为0.8升,其他条件均相同,反应器控制系统无异常。不知问题到底出在什么地方?

参考见解:根据我自己的经验,如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话,试试一下几点:

(1)接种时留一些细胞悬液,种回到方瓶或转瓶中,用与大罐相同的培养基同时培养,观察48小时内的生长情况,如果方瓶长势良好而罐子有问题,那就是操作的问题了

(2)不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率,只看仪表显示是不够的,有时液位太低可能探测到的不是真实值,你可以在接种前用水试试,把各种条件设的极端一些,容易发现问题

(3)有可能的话再做一次1.5L培养,看能否重现6月的结果,因为你说所有条件都一样可能是不准确的,有疏漏的地方

8、问:我培养的CHO细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情况很差,不伸展或伸展需要的时间很长,请问这主要是什么原因?

参考见解:我觉得可能的原因有如下几点:

(1)细胞本身贴壁生长的能力较弱,一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿,这样的话,就选择塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的,清洗干净,泡酸,冲洗干净,凉干之后,射线照射消毒或者就是紫外消毒也行,我们实验室就这样重复用培养板,没有什么问题。当然,太旧的还是扔了好了。

(2)培养液PH不好也会影响贴壁,配的时候加好缓冲试剂,不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。使用时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长,ph会有变化

(3)消化时候处理不合适,比如胰酶消化过久,有EDTA的话,去除不干净也影响贴壁的。消化完了之后要吸干净消化液,用培养液漂洗细胞,或者吹下来之后离心,换加新鲜培养液

(4)血清也可能影响贴壁,我观察过,细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清,尤其是Hyclone的血清,不过很贵

试试吧,有耐心点,等等它总会铺展开的。

9、问:最近我养CHO细胞,是从别人那里得来的。给我的时候细胞有一半是圆形一半是梭行的。但是养着养着就大部分成圆形,而且有的像荷包蛋一样,而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西,还有渐渐像融化了一样。是什么原因?

参考见解:听您的描述估计很可能是支原体污染。

建议马上丢弃该细胞,因为支原体污染很难去除,为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹豫。您可以重新索取或购买状态好的CHO细胞。

10、问:由于接种密度稍低一些,CHO细胞在2L转瓶中培养5天左右很难消化下来,即使消化下来也是成团的,请问为什么?加完血清的培养基又重新过滤了,会不会对细胞的生长速度有影响,一般培养三天就能张满。

参考见解:

(1)首先考虑一下你的胰酶有没有问题,也有可能是胰酶的浓度不够。

(2)成团也可能是细胞太多了,因此在消化时应该延长消化的时间,同时传代时尽量吹散成单细胞悬液。

(3)消化后传代时多弃去些细胞试试,也可以多传几瓶,三瓶,四瓶都是可以的。


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