CHO细胞在疫苗研制中的应用

分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。

1、CHO细胞表达体系及其特点

CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。

与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：

(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；

(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；

(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；

(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；

(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。

2、CHO细胞表达疫苗

（1）乙肝疫苗

CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有 CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而 CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由 CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该疫苗是以S蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。

许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的PreS部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。因此由 CHO细胞中表达的含S和PreS2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。以色列生产的新型疫苗。包含了S、PreS1、PreS2等3个基因，在CHO中表达的蛋白形成22 μm大小的颗粒，含有衣膜所有的抗原表位。

目前已投入市场的CHO表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所Gen Hevac B、以色列 Bio-Technology General公司的Bio-Hep-B、瑞士的Hepreeombe等。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。中国长春生物制品所的乙肝疫苗已正式生产。在现有的安全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好。在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。

在免疫原性方面，我国 CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。还有调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度。

（2）Epstein-Ban-病毒(EBV)疫苗

象其他疱疹病毒一样，EBV外周包绕一层脂质包膜。主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖蛋白组成，分子量分别为340kDa和220kDa。gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子量的50％以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。将含gp340/220基因的重组载体，转染CHO-A6细胞系和CHO dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。2周后小鼠血清中检测到明显的gp340/220特异性抗体，表明CHO细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为EB病毒基因工程亚单位疫苗。

国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。该种蛋白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同EBV受体、CD21结合的能力，说明重组蛋白同野生型EBVgp340/220结构相似。用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野生型EBV。

（3）艾滋病病毒(HIv)疫苗

HIV基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白Gag、聚合酶Pol和外膜蛋白Env。Env的前体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。目前针对HIV病毒研制的疫苗有多种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。

其中不同宿主细胞表达的以Env、Gag、Pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实验。其中CHO细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。重组载体转入CHO-L761h细胞系，获得可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。

纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护机体免受由低剂量的同类 HIV毒株攻击而导致的感染。但是在泰国给数千人免疫接种后无明显的保护效果。不过。在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射CHO表达的重组白介素12(ILl2)。所诱导的抗体水平是单一接种gp120疫苗的10倍；而新的I临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。

3、小结

由于CHO表达系统具有完善的翻译后修饰功能。对于一些特定的蛋白。特别是糖基化程度高的蛋白来说。是最为合适的表达体系。因此，除了以上介绍的3种病毒疫苗外。丙肝病毒、水痘一带状疱疹病毒亚单位疫苗在 CHO细胞中的表达在国内外均有研究。但CHO表达亚单位疫苗还存在着一些问题：

（1）单一的亚单位疫苗往往具有免疫原性弱的缺点；

（2）CHO细胞培养成本高、条件难控制。在一定程度上限制了CHO细胞表达亚单位疫苗的发展。

因此。应进一步研究CHO表达系统，对表达载体进行改造使之能容载更大片断的蛋白基因并提高表达量；改造CHO细胞使之更利于大规模生产；改进发酵工艺、纯化工艺。使CHO培养成本降低。